Prozessentwicklung/-kontrolle (PAT, cGMP), Plattformen für die Produktion von Proteinen und Virusähnlichen Partikeln

Projektbeschreibung

Um Forschungsergebnisse aus dem DRUID Konsortium in die Klinik oder die Industrie zu translatieren, sind robuste Produktionsprozesse, die mehr als eine bloße Maßstabsvergrößerung darstellen, unabdingbar. Dabei müssen diese Prozesse den Richtlinien der guten Herstellungspraxis (cGMP) und der Prozessanalytischen Technologie (PAT) folgen. Folgende Arbeiten sind geplant: i) Prozessintensivierung und Ausbau der BEVS-Produktionsplattform sowie Umsetzung einer kontinuierlichen Prozessführung, ii) Einbindung von online PAT-Technologie, z.B. Impedanzspektroskopie zur automatischen Bestimmung des optimalen Erntezeitpunkts und der automatisierten Ernte, iii) Expression (BEVS) und Aufreinigung von S. mansoni-Kinasen sowie Untersuchung der Kinasen und putativer Inhibitoren, und iv) Untersuchung neuartiger Transfektionsreagenzien für die transiente Proteinproduktion im Bioreaktormaßstab.

Optimierung des transienten Transfektionsprozesses mittels statistischer Versuchsplanung. ©IBPT

Produktionskonzept mit integrierter PAT-Technologie. ©IBPT

 

Wissenschaftliches Ziel:

Die Arbeiten zur Produktionsprozessentwicklung und Prozessanalytik werden weiter an die Fragestellungen des Zentrums angepasst, erweitert, und dem gesamten Konsortium zur Nutzung angeboten. Insbesondere ist geplant, die aufgebaute BEVS (Baculovirus-Expression-System)-Plattform weiter zu intensivieren und zu automatisieren. Darüber hinaus wird auch die zweite Produktionsplattform – die transiente Produktion mit HEK-293T-Zellen – weiterentwickelt.

 

DRUID-Kooperationspartner:

B4 AG Schlitzer, B5 AG Grevelding, B7 P AG Falcone, C6 NWG Häberlein, E1 Plattform Grevelding/Häberlein

Literatur E5: Biotechnol, DOI: 10.1016/j.ejbt.2021.08.002, 3. Lothert et al. (2020) Methods Mol Biol 2183:217-248, 4. Dekevic et al. (2022) J Biotechn 346 23-34, 5. Schwarz et al. (2021) Elec J Biotechnol, DOI: 10.1016/j.ejbt.2022.01.003; 6. Barekzai et al. (2020) New Adv Ferm Processes, DOI: 10.5772/intechopen.90029, 7. Eckhardt et al. (2021) Sep Sci Technol, 57 (6) 886-897

Hochauflösende, bildgebende Massenspektrometrie

Projektbeschreibung

Die hochauflösende, bildgebende Massenspektrometrie bietet vielfältige Einsatz–möglichkeiten, bei der Untersuchung von Pathogenen, der Pathogen-Wirts-Wechselwirkung sowie der Charakterisierung von Wirkstoffen. Die zu untersuchende Probe wird mithilfe eines Lasers abgerastert, die Schrittweite beträgt wenige Mikrometer. Hierbei wird Probenmaterial abgetragen und ionisiert, dies erlaubt die parallele Detektion hunderter chemischer Verbindungen sowie die bildliche Darstellung der Verteilung dieser Verbindungen in der Probe.  Die Identifizierung der Moleküle erfolgt durch hochpräzise Messung der Ionenmasse in Verbindung mit Fragmentierungsexperimenten. Durch kontinuierliche Verbesserung der Ionisierungsmethode können immer kleinere Strukturen dargestellt und niedrig konzentrierte Analyten durch beispielweise in-situ Derivatisierung detektiert werden.

 

 

Wissenschaftliches Ziel:

Das Ziel des Projekts ist die Verbesserung und Anwendung der vorhandenen Methoden auf Fragestellungen innerhalb des DRUID Zentrums. Wichtige Forschungsfelder sind insbesondere die Verteilung von Wirkstoffen, lipidomische und metabolomische Charaktierisierung von Pathogenen und die Pathogen-Wirts-Interaktion.

 

DRUID-Kooperationspartner:

A2 Grünweller lab, B4 Grevelding lab, B5 Schlitzer lab, D4 Taubert lab, E1 Häberlein lab, W3 Herker lab

Literatur E4: [1] Kadesch et al. (2020) PLoS Negl. Trop. Dis. 14(5): e0008145; [2] Morawietz et al. (2020), Front. Vet. Sci. 7, 611270; [3] Mokosch et al. (2021)  Anal Bioanal Chem 413, 2755–2766; [4] Müller et al. (2021) J. Am. Soc. Mass Spectrom.,3,32(2),465-472; [5] Spengler et al. (2015) Anal Chem 87 (1) 64-82.

Plattform Wirkstofftestung gegen Helminthen

Projektbeschreibung

Targetstrukturen anti-parasitärer Substanzen sind oft konserviert, was die Möglichkeit der Therapie unterschiedlicher Parasitosen mit demselben Wirkstoff eröffnet. Im Plattformprojekt E1 fokussieren wir uns auf verschiedene parasitäre Würmer (Helminthen), für die eine Entwicklung neuer Wirkstoffe aufgrund von Resistenzen bzw. suboptimaler Therapieerfolge hohe Dringlichkeit hat. Dazu führen wir in vitro-Screenings von Substanzen aus DRUID-Projekten u.a. gegen den Bilharzioseerreger Schistosoma mansoni und den Leberegel Fasciola hepatica durch. Das Plattformprojekt verfügt über zahlreiche nationale und internationale Kooperationspartner und -partnerinnen, auch in endemischen Ländern in Asien und Afrika, die uns Testmöglichkeiten gegen eine Vielzahl weiterer Helminthenspezies ermöglichen.

Strategie zur Identifizierung von Substanzen mit breitem Wirkspektrum gegenüber weltweit wichtige Helminthen-arten. ©Simone Häberlein

 

Für ausgewählte Substanzen werden zudem Wirkmechanismus-Analysen durchgeführt, wobei verschiedene in-vitro-Kultur-basierte und bildgebende Methoden zum Einsatz kommen.

Testmöglichkeiten des Helminthen-Plattformprojekts für Wirkstoffkandidaten. ©Simone Häberlein, Miray Tonk-Rügen

Wissenschaftliches Ziel:

Ziel des Projekts ist die Identifizierung von Substanzen mit breitem anti-parasitären Wirkspektrum sowie die Aufklärung konservierter Wirkmechanismen.

 

DRUID-Kooperationspartner:

A2 Grünweller lab, A6 Douglas lab, A7 Przyborski lab, B4 Schlitzer lab, B5 Grevelding lab, B7 Falcone lab, E4 Spengler lab

Literatur E1: 1. Peter-Ventura et al. (2019) ChemMedChem 14(21):1856-1862. 2. Houhou et al. (2019) Sci Rep 9:15867. 3. Li et al. (2019) Parasitol Res 118(3):881-890. 4. Morawietz et al. (2020) Front Vet Sci 7:611270. 5. Kellershohn et al. (2019) PLOS Negl Trop Dis 13:e0007240. 6. Tonk et al. (2020) Antibiotics 9:664. 7. Mokosch et al. Anal Bioanal Chem 413(10): 2755-2766. 8. Mughal et al. (2021a) Int J Parasitol 51(7):571-585. 9. Mughal et al. (2021b) Int J Parasitol S0020-7519(21)00312-X. 10. Gallinger et al. (2022) Pharmaceuticals 15(2): 119. 11. Morawietz et al. (2022) Parasitol Res (online ahead of print) doi: 10.1007/s00436-021-07388-1

Inhibition der Glutaminolyse und Glycolyse zur Hemmung der C. parvum-Infektion sowie One Health-Studie zur Kryptosporidiose in Kamerun

Projektbeschreibung

Kryptosporidien sind parasitäre Durchfallerreger beim Menschen, die insbesondere in Entwicklungsländern bei Kleinkindern und HIV-Infizierten zu hohen Morbiditäten und Todesfällen führen. Dabei sind die genauen infektionsbedingten Zusammenhänge in diversen Entwicklungsländern, wie z. B. Kamerun, nicht vollständig untersucht. Zur Therapie der Risikogruppen sind derzeit keine effektiven Medikamente erhältlich. Kryptosporidien sind obligat intrazelluläre Protozoen und verfügen selbst nur über minimale eigene Stoffwechselkapazitäten, daher müssen sie den Stoffwechsel der Wirtszelle zu ihrem Vorteil modulieren, um sich intrazellulär zu vermehren. Über die Charakterisierung der metabolischen Signaturen C. parvum-infizierter Wirtszellen konnten wir Stoffwechselreaktionen und -wege der Wirtzelle identifizieren, die für die Parasitenvermehrung essenziell sind.

Cryptosporidium parvum- (gelb) infizierte Wirtszellen (Zellkerne: blau), tomografische Mikroskopie © Juan Vélez

Hemmung von Cryptosporidium parvum über Stoffwechselinhibitoren (Vélez et al. 2021c)

 

 

Wissenschaftliches Ziel:

Das Projekt zielt darauf ab, strategische Angriffspunkte im Stoffwechsel der Wirtszelle (v. a. Glykolyse, Glutaminolyse) über neue Inhibitoren oder Kombinationsbehandlungen zu blockieren und damit indirekt die Parasitenentwicklung zu hemmen. Daneben wird eine One-Health-Studie zur Kryptosporidiose in Kamerun unter Berücksichtigung diverser epidemiologisch wichtiger Parameter durchgeführt.

 

DRUID-Kooperationspartner:

E4 Spengler lab

Literatur D4: 1. *Vélez et al. (2021a) Pathogens 11(1):49.  2.  * Vélez et al. (2021b) Biology 10(10):963 3. ** Vélez et al. (2021c) Biology 10(1):60

Charakterisierung apoptotischer Parasiten zur Identifizierung neuer Zielmoleküle für die Behandlung von Leishmaniose

Projektbeschreibung

Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch den Parasiten Leishmania spp. verursacht wird und in fast 100 Ländern endemisch ist. Wir konnten zeigen, dass apoptotische Leishmania major (L. major) Promastigoten sowohl für die Infektiosität als auch das Überleben von Parasiten in den Wirtszellen verantwortlich sind. Apoptotische Parasiten induzieren eine anti-inflammatorische Antwort in humanen Makrophagen, die zu keiner effektiven T-Zellantwort gegen Leishmanien führt. Auch wenn L. major Parasiten alle typischen Apoptose-Merkmale zeigen, sind jedoch typische eukaryotische Apoptose-regulierende Proteine in Leishmanien nicht vorhanden.

Färbung fragmentierter DNA (TUNEL staining) in L. major Cas9/T7, in denen durch Miltefosin Apoptose induziert wurde. (TUNEL: grün; DAPI: blau; anti-Lm-Serum: rot. ©Ger van Zandbergen)

 

Wissenschaftliches Ziel:

Für einen neuartigen Impfansatz und zur Tötung der Parasiten möchten wir zur Apoptose-regulierende Proteine in Leishmanien als mögliche neue Medikamenten-Targets identifizieren sowie attenuierte Leishmanien-Stämme ohne anti-inflammatorische Eigenschaften.

 

DRUID-Kooperationspartner:

B1 Kolb, B3 Rahlfs/Kolb, E3 Rahlfs/Przyborski

Literatur D3: 1. Arens et al. (2018) Front Immunol 31(9):1772. 2. Crauwels et al. (2019) Front Immunol 22(10):2697. Further publications within DRUID: 3. Turoňová et al. (2020) Science 370(6513):203-208.

HEV, Identifizierung zellulärer Targets für antivirale Strategien – Hemmung der Virusfreisetzung durch Modulation des Cholesterolspiegels

Projektbeschreibung

Das Hepatitis E Virus führt jährlich zu über 20 Mio. Infektionen weltweit und betrifft Industrienationen, besonders allerdings Entwicklungsländer. Limitierte Behandlungs-optionen sind häufig mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Da das unbehüllte Virus für seine Freisetzung endosomale Prozesse nutzt, bietet dies einen vielversprechenden Ansatzpunkt für neue Wirkstoffe. Im Rahmen der ersten Förderungsperiode wurde besonders die lysosomale Degradation von HEV im endosomalen System als zentraler Ankerpunkt antiviraler Aktivität identifiziert. Nebst angeborener Immunantwort spielt hierbei die zelluläre Cholesterolhomöostase eine essenzielle Rolle. Basierend darauf, sollen zugrundeliegende Regulationen besser charakterisiert werden, um den Weg für Drug-Repurposing Verfahren zu bereiten und neue, assoziierte Zielstrukturen zu identifizieren. Eine Erweiterung der bisherigen Systeme soll via Tiermodell auch auf die adaptive Immunantwort abzielen, um ein breites, klinisches Bild zu erhalten.

Dreidimensionale Rekonstruktion von HEV (grün) , GBP1 (cyan) und Lysosomen (rot) nach Behandlung mit Interferon .

Mittels CLSM erfasste, dreidimensionale Rekonstruktion von HEV (grün) in Lysosomen (cyan) nach Induktion einer Cholesterolakkumulation (magenta).

 

Wissenschaftliches Ziel:

Inhibition des endosomalen Lebenszyklus des HEV durch Modulation Cholesterol-abhängig regulierter Zielstrukturen mittels Applikation geeigneter Wirkstoffe („drug repurposing“).

 

DRUID-Kooperationspartner:

A2 Grünweller lab, A4 Heine/Reuter lab, B1 Diederich/Kolb lab, B6P Herker lab, C5 Glebe/Geyer lab, D1 Steinmetzer lab

Literatur D2: [1] Glitscher et al. (2018) Viruses 10(6):301; [2] Müller et al. (2020) Antiviral Res 174:104706; [3] Basic et al. (2019) Antiviral Res 172:104644; [4] Glitscher et al. (2021) J Virol doi: 10.1128/JVI.01564-20; [5] Glitscher et al. (2021) Cell Mol Gastroenterol Hepatol, doi:10.1016 /j.jcmgh.2021.02.002; [6] Himmelsbach et al. (2018) Emerg Microbes Infect 7(1):196. [7] Glitscher et al. (2021) Cell Microbiol. 16:e13379

Hemmung virusaktivierender Wirtsproteasen

Projektbeschreibung

Die Reifespaltung viraler Hüllproteine durch Wirtsproteasen ist essentiell für die Infektiosität vieler humanpathogener Viren. Zahlreiche Oberflächenglykoproteine, u.a. hochpathogener aviärer Influenzaviren (z.B. H5N1), des Chikungunyavirus oder von Dengue-, West-Nil und Zika-Virus, werden durch furinartige Serinproteasen aktiviert. Andere Virusproteine, wie das Hämagglutinin zoonotischer H7N9 und saisonaler Influenza-A-Viren oder das Spike-Protein S vieler Coronaviren (CoV) werden durch die membranständige trypsinartige Serinprotease TMPRSS2 gespalten. Zuletzt konnten wir zeigen, dass das SARS-CoV-2 S sowohl durch Furin als auch TMPRSS2 aktiviert wird. Daher sind diese Wirtsproteasen vielversprechende Targets zur Entwicklung neuartiger antiviraler Wirkstoffe mit breitem Wirkungsspektrum.

Kristallstruktur des Furins im Komplex mit Inhibitor MI-1851.

Kristallstruktur der TMPRSS2 überlagert mit den Inhibitoren MI-1904 (gelbe) und MI-432 (orange).

 

Wissenschaftliches Ziel:

Im Rahmen des Projekts sollen strukturbasiert hochwirksame Hemmstoffe der virusaktivierenden Wirtsproteasen Furin und TMPRSS2 entwickelt, charakterisiert und auf ihre antivirale Wirksamkeit in Zellkultur und im Tiermodell geprüft werden.

 

DRUID-Kooperationspartner:

A1 Becker lab, A2 Grünweller lab, B6 Herker lab, C1 Hildt lab

Literatur D1:  1. Böttcher et al. (2006) J Virol 80: 9896-8 3. Becker et al. (2012) J Biol Chem 287: 21992-03 4. Böttcher-Friebertshäuser et al. (2012) Vaccine 30: 7374-80 5. Ivanova et al. (2017) ChemMedChem 12: 1953-68 6. Lam van et al. (2019) ChemMedChem 14, 673-85 7. Bestle et al. (2020) LSA 3: e202000786  8. Bestle et al. (2021) J Virol 95: e0090621 9. Lam van et al. (2021) ACS Med Chem Lett 12: 426-32. 

Das Fasciola-Kinom als Quelle für neue Wirkstofftargets

Projektbeschreibung

Proteinkinasen regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse und stellen vielversprechende Ziele für Medikamente dar, nicht nur in der Krebstherapie sondern auch gegen parasitäre Infektionserreger. Beide Erkrankungen haben u.a. gemein, dass Stammzellen eine besondere Rolle beim Wachstum spielen. Unsere Hypothese ist, dass die Inhibierung ausgewählter Proteinkinasen als Therapieansatz gegen den Leberegel Fasciola hepatica genutzt werden kann, einem weltweit vorkommenden Zoonose- und NTD-Erreger. Im Rahmen des Projektes werden (1) potentielle Wirkstoffziele im Fasciola-Kinom bioinformatisch identifiziert und genetisch validiert, (2) gegen den Leberegel aktive Kinase-Inhibitoren identifiziert, sowie (3) die Wirkungsweise von Kinase-Inhibitoren mit biochemischen und bildgebenden Methoden charakterisiert.

U.a. haben wir in Kooperation mit der AG Spengler (Projekt E4) den Einsatz der bildgebenden AP-MALDI-Massenspektrometrie für “Drug Imaging” in Parasiten-gewebe etabliert und können so Aufnahmeroute, -kinetik und Wirkstofftropismus von Kinase-inhibitoren in Leberegeln unter-suchen.

Strategie zur Identifizierung von Proteinkinase-Inhibitoren als Wirkstoffkandidat gegen den Leberegel Fasciola hepatica. ©Simone Häberlein

 

Wissenschaftliches Ziel:

Ziel des Projekts ist es, Proteinkinase-Inhibitoren als neue Wirkstoff-kandidaten gegen Fasciolose zu finden.

 

DRUID-Kooperationspartner:

A2 Grünweller lab, B4 Schlitzer lab, B5 Grevelding lab, B7 Falcone lab, E4 Spengler lab

Literatur C6: 1. Houhou et al. (2019) Sci Rep 9:15867. 2. Li et al. (2019) Parasitol Res 118(3):881-890. 3. Morawietz et al. (2020) Front Vet Sci 7:611270. 4. Mokosch et al. Anal Bioanal Chem 413(10): 2755-2766. 5. Morawietz et al. (2022) Parasitol Res (online ahead of print) doi: 10.1007/s00436-021-07388-1

Targets für antivirale Strategien gegen das Zika Virus

Projektbeschreibung

Zika-Viren (ZIKV) sind Arboviren aus der Familie der Flaviviren. Im Zuge der ZIKV Epidemie 2015/2016 hat die WHO am 01.02.2016 den Ausbruch in Südamerika zum Public Health Emergency of International Concern (PHEIC) erklärt, da es einen Zusammenhang zwischen der Zika-Virus-Infektion Schwangerer und dem Auftreten von Mikrozephalien bei Neugeborenen gibt. Derzeit steht weder eine Impfung noch eine spez. Therapie zur Verfügung. Durch Hemmung der Virusreplikation bereits in der frühen Phase der Infektion ggf. mittels einer temporären präventiven Strategie könnte die Viruslast deutlich reduziert und so die Verbreitung des Virus und so auch das Risiko einer intrauterinen Infektion vermindert werden. Im Rahmen der ersten Förderperiode konnten Zielstrukturen für antivirale Ansätze identifiziert werden.

Intrazelluäre Verteilung von Tetherin (rot) und dem ZIKV Hüllprotein E (grün) in Zellen infiziert mit zwei verschiedenen ZIKV Isolaten (Uganda bzw. Polynesia)

 

Wissenschaftliches Ziel:

Basierend auf bereits identifizierten Zielstrukturen und weiterer Zielstrukturen sollen antivirale Strategien entwickelt, der Mechanismus charakterisiert und deren Wirkung auch auf weitere Flaviviren untersucht werden.

 

DRUID-Kooperationspartner:

A2 AG Grünweller, B1 AG Diderich/Kolb, B6P AG Herker, C2 AG Kempf, C5 AG Glebe/Geyer, D1 AG Steinmetzer, E6 AG Schiffmann/Laux

Literatur C1: 1. Herrlein et al. (2021) J Virol. doi: 10.1128/jvi.02117-2  2. Sabino et al (2021)., J Virol. doi: 10.1128 3. *Maddaluno et al., 2020 EMBO Mol Med. doi: 10.15252/emmm.201911793 4. Basic et al. 2019 Antiviral Res. doi: 10.1016/j.antiviral.2019.104644. 5. Akhras et al. (2019) Viruses doi: 10.3390/v11080748. 6.  Sabino et al., (2019) doi: 10.3390/v11060524 7. Elgner et al (2018) Viruses doi: 10.3390/v10040149

Identifizierung von antiviralen Targets im Lipidmetabolismus

Projektbeschreibung

Die humanpathogenen Flaviviren Dengue (DENV), Gelbfieber (YFV), Zika (ZIKV), West-Nil (WNV) und das Frühsommer-Meningoenzephalitisvirus (TBEV/FSME) verursachen akute Infektionen mit teils schweren Komplikationen. Fundamentale Schritte in der Flavivirusreplikation sind eng mit zellulären Lipiden verknüpft. Hierzu zählen unter anderem Membranreorganisationen zur Bildung der Replikationsvesikel oder die Bildung der Virushülle. Flaviviren verändern die Lipidkomposition der Wirtszelle zu ihrem Vorteil, und die Aktivität verschiedener lipidmetabolisierender Enzyme ist essentiell für die erfolgreiche Replikation. Aus diesem Grund stellen Enzyme verschiedener Lipidstoffwechselwege interessante Targets für eine (pan-) antiflavivirale Therapie dar. Allerdings ist noch nicht detailliert geklärt, ob die o.g. Vertreter der Flaviviren auf unterschiedliche oder ähnliche Zweige des Lipidmetabolismus angewiesen sind.

Immunfluoreszenzmikroskopie von Zellen, die mit verschiedenen Flaviviren infiziert sind; rot: virales E-Protein; grün: lipid droplet

 

Wissenschaftliches Ziel:

Das Projekt zielt darauf ab, antivirale Angriffspunkte im zellulären Lipidmetabolismus zu identifizieren. Hierbei wird die Rolle verschiedener Schlüsselenzyme der de novo Fettsäure- und Cholesterol-Biosynthese, des Phospholipid- und Neutrallipidstoffwechsels, sowie von Enzymen der Lipidremodellierung in der Flavivirusreplikation mittels eines shRNA-basierten Screenings analysiert. Zusätzlich werden verschiedene Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse werden in verschiedenen Zelltypen validiert und die molekularen Mechanismen detailliert untersucht.

 

DRUID-Kooperationspartner:

B1 Diederich/Kolb, D1 Böttcher-Friebertshäuser/Steinmetzer, E7P Krijnse-Locker, E4 Spengler

Literatur B6P: 1. Herker et al. (2010) Nat Med 16: 1295 2. Harris et al. (2011) J Biol Chem 286: 42615 3. Herker et al. (2012) J Biol Chem 287: 2280 4. Rosch et al. (2016) Cell Rep 16: 3219 5. Hofmann et al. (2018) Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids 1863: 1041 6. Schobel et al. (2018) Sci Rep 8: 3893 7. Lassen et al. (2019) J Cell Sci 132: jcs.217042 8. Bley et al. (2020) Int J Mol Sci 21:  9. Herker et al. (2021) Trends Cell Biol 31: 345 10. Nguyen-Dinh et al. (2021) Cells 10: 2407